正异丁醇作为燃料添加剂，对抑制储存汽油微生物降解起到什么作用
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文 | 小王加薪
编辑 | 小王加薪
前言
由于细菌和真菌在燃料、水界面形成生物膜并产生有机酸和硫化物，汽油在燃料储存过程中可能发生生物结垢。
燃料添加剂用于汽油是为了防止生物结垢，但相对昂贵，对生物膜并不总是有效，而且对汽油的可燃性没有贡献。
生物异丁醇是一种经过批准和认证的先进生物燃料，在汽油混合物“iBut16”中添加高达16% ，正丁醇混合物目前正在审查中。
当水浓度>2-3%时，正丁醇或异丁醇对微生物有抑制作用，我们确定了正丁醇在模型汽油、水系统的水相中分别以10%和24%的浓度达到42 g/L和48 g/L。
同样，在汽油中以10%和24%混合的异丁醇分别在45 g/L和53 g/L的水相中分离，几种来自燃料储罐的细菌和真菌菌株，或已知的耐溶剂菌株，在n-和异丁醇浓度范围内的生长潜力进行了评估。
当n-丁醇和异丁醇浓度分别为1.5和2.0%时，所有菌株的生长速率均比未处理的对照降低40-100%。
在溶剂浓度为3.0%时，没有观察到任何微生物的生长，正丁醇或异丁醇的两亲性和混沌性有助于它们抑制微生物的生长，在燃料储存期间可以作为有效的生物杀灭剂和有价值的燃料添加剂。
今天，小王将为大家介绍正丁醇或异丁醇对抑制储存汽油微生物降解的过程。
怎样抑制微生物的生长？
大量液体运输燃料的长期储存在长期保持燃料质量方面存在重大问题，燃料在储存过程中的生物降解被认为是一个日益重要的问题。
这种劣化造成燃料损失，但更重要的是质量损失、生物膜形成和有机酸生成，这些问题既发生在石油基燃料中，也发生在许多生物燃料中。
在碳氢化合物基燃料中，吸附水的任何相分离都会沉降到储罐底部，这阻碍了大多数就地清洁的方法。
当我们使用典型生物燃料的混合物时，由于酒精、碳氢化合物混合物的吸水性，水相问题更加复杂。
此外，与汽油或柴油相比，许多生物燃料对微生物群落的可生物降解性更强。
目前在燃料混合物中使用的大多数特定的杀菌剂都很昂贵，因此在微量使用时很难将其分离到降解微生物所在的水相。
正丁醇和异丁醇的混沌性使这些4碳醇对微生物具有高度毒性，可能作为有效的可再生生物杀菌剂用于燃料混合物中。
生物异丁醇已被批准作为汽油添加剂，但尚未广泛使用，由于正丁醇和异丁醇的两亲性，这些溶剂应以抑制水平从燃料混合物中分离到次要水相，并杀死现有的微生物或防止侵入燃料储存容器的新污染生物的建立和生长。
如果一种有价值的燃料添加剂氧合物也能被证明，对广泛的燃料工业问题具有生物杀灭价值，同时还具有其作为可再生燃料混合物和辛烷值增强剂的直接价值，这可能会提供市场和价值激励，帮助克服这些生物燃料目前的经济障碍。
在这项概念验证研究中，我们确定了分配到汽油、水混合物水相的n-和异丁醇的浓度，并假设会积累足够的滴度来抑制微生物的生长。
同时，我们选择了几种从燃料储罐中分离出来的生物，或者已经注意到具有相对程度的固有溶剂耐受性。
材料与方法
用三次重复实验测定了100%汽油中正丁醇和异丁醇在水中的分馏，将这些醇分别以0%、10%、16%、20%和24%混合，其余的用汽油填充，并在1升B级刻度汽缸中平衡到正好1.000升的总容积，该汽缸具有长度标准锥形和特氟龙塞。
然后加入10.0 mL的纯蒸馏水，将烧瓶倒转5次，汽油从测试库存桶中提供，最初来自Haltermann Solutions EPA Tier II EEE。
正丁醇和异丁醇为Sigma-Aldrich试剂级，然后，它们被转移到1-L Squibb梨形分离漏斗。
混合物在通风柜中保持27℃平衡至少24小时，每个漏斗的底部水相释放到50ml相同类型的漏斗中，以及少量平衡的有机上层相，以捕获所有的水相。
最后，将所有的水相排到一个10ml的刻度筒中，测量水相的体积，随着酒精浓度的增加，更多的水反隔板进入有机相。
采用高效液相色谱法，在Aminex HPX-87H柱中测定正丁醇和异丁醇在60℃流速为0.5 mL/min，流动相为5 mM H2SO4，在Shimadzu日立模块系统中测定正丁醇和异丁醇在50℃下的RID检测器RID- 20a。
本研究使用的微生物有枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌DH5a、恶臭假单胞菌KT2440、酿酒酵母菌D5A 、多脂耶洛氏菌ATCC 46483、可看比氏杆菌ATCC 32950。
培养脂解酵母的固体培养基为YM琼脂，以及培养枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和恶臭杆菌的固体培养基为LB琼脂，培养酿酒酵母的固体培养基为YPD琼脂。
在0.2X Luria-Bertani肉汤中培养枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和恶臭杆菌，酿酒酵母和脂肪瘤酵母生长的液体培养基为0.1X YPD肉汤。
培养贝氏梭菌的液体培养基为0.2倍增强梭菌培养基，除可疑芽孢杆菌外，其余微生物在27℃的10ml液体培养基中生长，以140 rpm摇匀。
使用Milton Roy Spectronic 21D分光光度计在600 nm处每隔2小时测量OD，潜伏期从14到28小时不等，取决于达到固定阶段的时间。
采用Hungate技术在厌氧条件下培养beijerinckii，B. spectabilis生长在0.2X马铃薯葡萄糖琼脂上，因为它在液体培养基中絮凝，无法准确测量OD。
将10ml液体培养液接种于PDA板的中心，然后用Parafilm包裹，倒置放置于塑料套筒中，以减少溶剂蒸发。
27℃孵育96 h，使菌落形成，菌落大小与无溶剂对照板进行比较，正丁醇和异丁醇的检测浓度分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和3.0%。
在每种条件下，所有的生物都被培养成三份。
丁醇在水或溶剂燃料系统中的分配
测定了正丁醇和异丁醇从汽油本体有机相向添加的水相的分配，以确定可抑制微生物生长的4碳醇的有效浓度。
基于饱和度和辛醇-水系数的初始估计可根据以下式子估算。
其中，正辛醇、水分配系数是未电离溶质，在含有正辛醇和水的两相体系中分配的浓度比的对数。
Poct/wat值大于1.00的溶质更容易脂溶或疏水，而低于1.00的溶质则有利于水环境。
脂肪族醇正丁醇和异丁醇的logP值分别接近1.00，分别为0.88和0.76，这表明由于它们的两亲性，它们将分为有机相和水相。
从这些实验中，我们得到了正丁醇的平均结果，这些结果表明，异丁醇从汽油到水的分配略高于正丁醇。
这些结果与先前报道的醇、汽油、水三元相图一致，在水相中测量了微量乙醇，通常小于0.1 g/L，我们认为这是来自原始汽油库存。
当不向汽油中加入溶剂时，平衡水相的体积保持在10ml。
为了评估n-丁醇和异丁醇对每种选定菌株的毒性，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0和3.0% (v/v)的溶剂中生长。
所有菌株均在肉汤培养基中培养，除在固体培养基上评价的异芽孢杆菌外，均为三次。
培养基对细菌菌株和酵母菌株分别稀释5倍和10倍，以模拟燃料箱水相环境中较低的营养浓度。
在嗜中性范围内有共同的pH要求，在温范围内有共同的生长温度要求，稀释后的培养基在整个生长实验过程中保持了足够的缓冲能力以维持pH要求。
通过计算每个菌株的比生长率，并将每种条件下的比生长率归一化到无溶剂对照的最大比生长率，来评估对溶剂的敏感性。
C.beijerinckii BA101是一种已知的产丁醇发酵厌氧菌，在正丁醇浓度为0.5、1.0、1.5和2.0% (v/v)时，其相对生长速率分别为84.7、81.4、8.2和0.0%。
据报道，该菌株在特定发酵条件下产生并耐受20 g/L的正丁醇，恶臭假单胞菌被认为是一种耐溶剂微生物，具有分解多种芳香族化合物的能力。
我们的菌株KT2440在0.5% (v/v)的正丁醇中生长，其生长速率为其最大速率的74.0%，但在更高的浓度下完全被抑制。
常见的革兰氏阳性模式生物枯草芽孢杆菌菌株168在正丁醇浓度为0.5、1.0、1.5、2.0和3.0% (v/v)时，耐受性分别为其最大相对生长率的88.4、76.8、58.1、32.7和0.0%。
枯草芽孢杆菌已被设计为通过异源途径表达产生正丁醇，尽管其滴度很低，菌株已适应在高达2.25% (v/v)的浓度下生长。
正丁醇毒性结果
本实验所用的枯草芽孢杆菌168菌株在2.0% (v/v)正丁醇中也能生长，是本实验条件下对溶剂耐受性最强的微生物。
另一种常见的微生物，大肠杆菌DH5a，可以耐受高达2.0% (v/v)的正丁醇浓度，并在每种条件下保持94.3、39.5、20.6和12.3%的相对生长速率，而在3.0%正丁醇浓度下没有生长。
人们对大肠杆菌进行了大量研究，以使其成为生产正丁醇的菌株，并通过适应性进化提高其耐受性<17>;然而，耐受工业上相关的正丁醇滴度仍然具有挑战性。
我们还选择了酵母菌，Y. lipolytica ，它是从柴油燃料箱中分离出来的，已被证明可以分解一系列芳香烃，包括萘、联苯和苯并芘。
在我们的实验中，聚脂Y. lipolytica对正丁醇的耐受性相对较差，在0.5%的溶剂存在下，其最大相对生长量维持在75.4%，但在更高的浓度下没有生长。
相比之下，具有高度乙醇耐受性的酿酒酵母在2% (v/v)正丁醇浓度下仍能繁殖，在0.5、1.0、1.5和2.0%正丁醇浓度下的相对生长率分别为80.6、63.3、34.2和6.6%。
这种真菌名为Byssochlamys spectabilis ATCC 32950，是从航空燃料储罐中形成的生物膜群落中分离出来的，其他菌株已知可以降解燃料，特别是生物柴油。
B.spectabilis ATCC 32950在摇瓶中生长时形成团块,因此，抑制试验是在琼脂板上进行的，注入的溶剂浓度与液体培养中使用的溶剂浓度相对应。
将PDA琼脂培养基调至pH 5.0，以促进酸性真菌的生长,为避免溶剂蒸发，在27℃的塑料袋中孵育96小时后，从中心接种点开始测量真菌生长的菌落直径。
B. spectabilis对正丁醇表现出高度敏感性，在1.0% (v/v)正丁醇存在下生长时，菌落大小减少了约86%,较高的浓度导致接种中心点以外几乎没有生长。
当暴露于3% (v/v)正丁醇时，本研究选择的菌株均未显示出任何可检测到的生长。
四种细菌和两种真菌菌株在正丁醇和异丁醇水平增加时的相对生长率，将3个重复培养的平均最大对数生长速率与未处理对照的最大生长速率进行归一化，并以生长速率降低的百分比表示。
异丁醇毒性结果
总的来说，我们观察到与正丁醇相比，在异丁醇存在下，相对生长率也有类似的下降。
在0.5、1.0和1.5% (v/v)的生长过程中，贝氏c.b beijerinckii耐受异丁醇浓度高达1.5% (v/v)，相对于对照培养物，其平均生长率分别为81.6、76.6和38.4%。
在1.0% (v/v)异丁醇浓度下，腐臭假单胞菌和脂肪瘤假单胞菌均被完全抑制。
相比之下，枯草芽孢杆菌耐受浓度更高，在0.5、1.0、1.5和2.0% (v/v)异丁醇浓度下的相对增长率分别为83.1、77.4、64.6和40.8%。
革兰氏阴性菌大肠杆菌的耐受性也强于恶臭杆菌，在0.5、1.0、1.5和2.0% (v/v)异丁醇浓度下，其生长速率分别为最大生长速率的84.4、70.1、14.9和6.5%。
最后，所选酵母菌S. cerevisiae对异丁醇的耐受性高达2.0% (v/v)，在0.5、1.0条件下的相对生长率分别为未抑制对照的87.5、76.8、47.8和13.5%。
如上所述，异丁醇已被批准作为汽油中浓度高达16% (v/v)的燃料添加剂，可再生异丁醇是一种具有工业价值的目标生物燃料，一些微生物已被设计用于从碳水化合物中生产溶剂，包括大肠杆菌、恶臭杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。
这项工作的结果表明，这些生物确实具有对异丁醇毒性的固有水平的抗性，但不能在分配实验中观察到的浓度下生长。
同样，当暴露于1.0% (v/v)浓度时，B. spectabilis对异丁醇的反应与正丁醇相似，其生长减少86%，超过该浓度时几乎不知道生长发生，在3.0% (v/v)浓度的异丁醇时，没有菌株显示浊度增加。
结语
液体运输燃料，包括从石油中提炼或从可再生资源中生产的燃料，在储罐中长期储存期间容易受到微生物污染。
在这个概念验证研究中，我们已经证明了两亲性溶剂正丁醇和异丁醇，当以预期的浓度添加到汽油中时，会在足够的浓度下分解成添加的水相，从而抑制几种微生物的生长。
这些生物包括被认为是耐溶剂菌株或模式生物燃料生产菌株，以及从燃料储罐中分离出来的特殊芽孢杆菌。
这些溶剂也可以由可再生原料作为生物燃料生产，不仅可以作为合适的混合氧化剂，还可以作为有效的增值抑制剂，防止燃料储存过程中的微生物污染、变质和腐蚀。
这些结果表明，在汽油以外的其他燃料中添加正丁醇或异丁醇可能具有迄今未被考虑的杀生作用。
生物柴油和生物柴油、柴油混合物特别容易受到微生物生长的影响。
我们希望在未来的研究中评估石油柴油、生物柴油或与正丁醇和异丁醇的海洋混合物，以控制微生物的生物污染和生物降解。