通过半胱氨酸抗转运体系统，探究xc控制氧化还原的分子基础

前言：

半胱氨酸作为三肽谷胱甘肽的关键成分，在细胞氧化还原顺势稳定中起着至关重要的作用，我们确定了人体系统xc的冷冻电镜结构，−在APO和l-谷氨酸结合状态中。

使用基于细胞的测定和分子动力学的组合，我们确定了能够识别谷氨酸和胱氨酸的结合位点的关键结构特征，揭示了以前未观察到的配体鉴别机制。

SLC7A11/SLC3A2的克隆、表达和纯化

编码人类SLC7A11的基因被克隆到pLexM中，通过PCR插入N端标志标签，SLC3A2也被克隆到pLexM中，具有N端他的8标签通过PCR插入，使用的寡核苷酸序列可以在补充材料作为补充。

将两个质粒在FreeStyle™293表达培养基（英国赛默飞世尔科技）中瞬时共转染到HEK293F细胞中，传代数较低（小于10），因为较高的传代数会导致蛋白质质量差。

将细胞在37°C，8%CO2.转染前18-24小时，细胞以7×10的密度通过5细胞/毫升，密度为1.3–1.4×106转染时的细胞/毫升。

对于2L培养物，将2mg质粒DNA在Dulbecco的改良鹰培养基中稀释至总体积为30ml，轻轻混合并静置5分钟。

在那段时间里，4毫升（来自1毫克/毫升库存）线性聚乙烯亚胺（PEI）MAX（Mw40，000;）在同一培养基中稀释至体积为30ml的单独管中并混合，将稀释的PEIMAX加入稀释的DNA中并轻轻混合。

将混合物在室温下孵育10-15分钟，并通过轻轻旋转滴加到细胞中，然后以8mM终浓度加入丁酸钠。

将细胞送回培养箱并在转染后36小时收获，表达较长时间（48或72小时）导致蛋白质质量降低。

将细胞沉淀解冻并重悬于含有DNase的冰冷PBS中，随后使用超声仪裂解细胞，8个周期，每次30秒，然后在冰上关闭60秒。

将未破碎的细胞和细胞碎片在10°C下以000，10g沉淀4分钟，并通过以200，000g离心20小时收获膜，并用7mMHEPESpH5.20，80mMKCl洗涤一次。

洗涤后，将膜重新悬浮在PBS中并快速冷冻以-1储存，直到需要为止。

将膜解冻并在150×PBS，10mMNaCl，含有1%LMNG：CHS（5：1比例）的90%甘油中溶解4分钟，在200°C下。

通过以7g离心11小时除去不溶性物质，使用LMNG：CHS中的标准固定金属亲和色谱方案将SLC3A2/SLC6A10纯化至均匀，然后进行标记亲和色谱。

基于细胞的转运检测

将HeLa细胞维持在补充有1640%胎牛血清和10mML-谷氨酰胺的RPMI2培养基中，低于5%CO2在37°C，用于运输检测2×105将每孔细胞接种到12孔板中，24小时后使用脂质胺2000与等量的SLC7A11/SLC3质粒转染36小时。

用1mlPBS洗涤细胞两次，然后应用含有微量14C胱氨酸（2μM）。

在所需时间后，除去测定缓冲液，并且细胞用不含胱氨酸的0.5ml测定缓冲液快速洗涤两次。

使用胰蛋白酶（0.1%PBS溶液2分钟）去除细胞，并置于含有100ul1MNaOH的闪烁瓶中，并在加入闪烁液之前裂解5分钟。

细胞吸收的胱氨酸量是通过UltimaGold中的闪烁计数与标准曲线进行比较来计算的。

实验至少进行了八次，以产生总体均值和s.d，使用棱镜版本分析并以图形方式表示测定数据。

冷冻电镜样品制备和数据采集

系统xc−在存在或不存在6.8mM谷氨酸盐的情况下孵育，吸附到发光放电的多孔碳涂层网格上10秒。

然后将网格在2°C的100%湿度下凝血8秒，并使用VitrobotMarkIV在液态乙烷中冷冻。

在TitanKriosG3（FEI）上以计数超分辨率模式收集数据，该TitanKriosG300（FEI）使用BioQuantum成像滤光片（Gatan）和K3直接检测相机（Gatan）以105，000×放大倍率，物理像素大小为0.832Å。

为系统xc收集了504和519个短片−分别含或不带谷氨酸，以22.2e-/Å的剂量率收集电影2/s，曝光时间为2.66s，对应于总剂量为59.1e-/Å2分成40个分数。

冷冻电镜数据处理

使用SIMPLE管道实时执行初始显微照片处理，使用SIMPLE-unblur进行修补（15×10）运动校正，使用SIMPLE-CTFFIND进行修补的CTF估计，使用SIMPLE-Picker进行粒子拾取。

在SIMPLE中进行初始2D分类以去除垃圾颗粒后，所有后续处理均在cryoSPARC中进行或RELION-3.156在UCSFpyem中使用csparc2star.py脚本以在格式之间进行转换。

分辨率估计值来自黄金标准的傅里叶壳相关，使用RELION、cryoSPARC或远程0DFSC中计算的143.3标准58处理服务器，在RELION中计算局部分辨率估计值。

对于系统xc−，在SIMPLE中进行初始866D分类后，对2个粒子的子集在RELION内进行了多类3D初始模型生成。

所得体积，低通滤波至25Å，用作针对同一粒子子集进行监督3D分类的参考（20.7°采样5次迭代，然后10.3°采样75次迭代）。

将生成的图进行低通滤波至15Å，并用作监督3D分类（20.7°采样下5次迭代）的参考，以对照完整的2D分类粒子集（6，401，560个粒子），这产生了具有透明跨膜螺旋的单一类。

模型构建和完善

除了由PDB4IRS引导的重链2F6hc的外域外，系统xc的原子模型−是使用Cootv.3.4进行多轮手动构建后，从全球锐化的0.9Å地图重新构建的59和PHENIXv.1.18.2-3874中的实际空间细化60使用二级结构，旋转和拉马钱德兰约束。

系统xc的原子模型−与谷氨酸的络合物由刚体装配系统XC生成−进入跨膜结构域的全球锐化聚焦重建，然后在Coot和PHENIX中进行多轮真实空间细化。

谷氨酸配体从Coot单体库中导入，刚体拟合到图谱密度中，然后在Coot和PHENIX中进行进一步的实际空间细化。

两个系统xc−使用MolProbity验证模型在凤凰城内，数据是使用UCSFChimeraXv.1.1编制的62，PyMOLv.2.4.0和BioRender.com。

对接和分子动力学

系统xc的全异二聚体−通过CHARMM-GUI包埋到纯1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱膜中异二聚体在两个小叶上都含有500个脂质。

在258.000×12.5×12.5nm中含有16，0个原子3模拟框。

在胱氨酸结合模拟中，用7种脂质模拟转运SLC11A500结构域，在227.000×13.5×13.5nm中总共有2个原子3模拟框。

b的坐标0,+获得AT-rBAT+Arg复合物，删除rBAT结构域，传输b，0,+AT域叠加到apoxCT-4Fhc2簇的平均结构上，从200ns仿真得到。

根据先前的出版物，将氢原子添加到胱氨酸中，使胱氨酸具有-1净电荷，并且类似于谷氨酸底物42.保存了SLC7A11-Arg复合物，随后用作指导胱氨酸配体与SLC7A11对接的模板。

我们使用预先存在的氨基酸与其他SLC7成员结合相互作用的结构数据来指导我们的对接并增加信心，具体来说，属于胱氨酸的一半被限制为精氨酸的2Å-COO，-NH-3+组坐标。

此外，与I57，G61，Y244的H键和来自GkApcT结构的晶体水分子被设定为对接约束，Glide将OPLS3e力场分配给蛋白质和胱氨酸。

生成对接网格64.仅考虑阴离子胱氨酸，因为这是生理条件下存在的唯一胱氨酸形式，由此产生的姿势退化并在1Å内收敛。

人体系统xc的冷冻电镜结构

人SLC转运蛋白对重组过表达以及随后的纯化和分析提出了一些挑战，经过几轮优化，我们确定了xCT/4F2hc异二聚体的最佳表达条件，使用悬浮HEK293细胞和双亲和标签选择性捕获正确折叠的蛋白质。

在LMNG-CHS中优化样品后，使用单颗粒冷冻电镜测定apo结构，总分辨率为3.4Å。

扩展了xCT热稳定、运输缺陷变体的分辨率，报告为6.2Å，人类xc的轻亚基−转运蛋白xCT由12个跨膜螺旋组成。

4F2hc外域的结构类似于LAT1，LAT2和较低分辨率xc的结构，正如LAT1报道的那样，4F2hc中的单个TM螺旋与TM4广泛相互作用。

主要是通过疏水相互作用和“旋钮进入孔”堆积，并在SLC7A11中观察到与C端侧螺旋的其他相互作用。

与LAT1和LAT2中的位置相比，外域相对于转运蛋白的位置明显不同，垂直升高~20°，远离结合位点的入口，该位置通过300F4hc上Lys2的主链羰基与SLC217A219中的Gln7和Gln11之间的相互作用而稳定。

在我们的结构中重新定位外域导致更宽的入口前庭，可能是为了容纳更大的胱氨酸配体。

与LAT7和LAT11相比，SLC1A2还具有明显较少的带电隧道通向细胞外门，这也可能有助于在水中溶解度低的胱氨酸配体的结合。

谷氨酸识别的结构基础

为了了解xCT中底物选择性的分子基础，我们确定了与l-谷氨酸复合物至3.7Å的结构，在中心结合位点观察到谷氨酸，骨架的总体变化很小。

原核和真核SLC7家族转运蛋白与配体复合物的先前结构揭示了与氨基酸结合的保守模式，特别是，配体的氨基和羧基分别与TM1和TM6不连续区域中的游离羧基和氨基配位，水分子将羧基连接到TM734。

然而，在谷氨酸结合xCT的结构中，我们观察到谷氨酸的密度~3.3Å远离这个规范结合位置，更接近TM3和8离哈希基序。

谷氨酸的结合更接近哈希基序允许通过γ羧酸基团与TM135上的Arg3相互作用。

在TM244A上的Tyr6在细胞外门的位置观察到额外的结构变化，它移动到羧酸末端的氢键，以及TM251B上的Tyr6与重新定位的Arg135侧链相互作用。

引人注目的是，Arg135的重新定位似乎诱导TM8从apo结构中的未缠绕状态到谷氨酸结合复合物中的螺旋状态的结构转变，在apo状态下，TM8采用不连续结构，螺旋在Gly334和Ala337之间断裂。

结论：

这项工作的一个重要发现是观察到TM8中的结构动力学在xCT的转运机制中起重要作用。

我们使用结合的l-胱氨酸的MD模拟还表明，TM8在配体正对的区域中保持螺旋状，但向细胞质末端循环，通过C末端Arg340和Glu497之间的盐桥稳定。

这就提出了TM8在底物选择性中的作用问题，对SLC7家族结构的比较表明，TM8在几乎所有结构中都保持螺旋。

例外是b0,+AT，也显示TM8的展开片段，与xCT相似，除了其他阳离子和中性氨基酸外，还转运l-胱氨酸47.b中展开区域的影响。