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通过杂多价大环共组装识别和清除β-淀粉样蛋白

预计到2050年全球全世界每85个人中就有1人名AD患者。β-淀粉样蛋白（Aβ）产生和清除的不平衡导致Aβ1-42单体聚集形成纤维和淀粉样斑块，是AD发病机制中不可或缺的过程，最终导致病理变化和认知障碍。因此，Aβ已经成为治疗AD药物最重要的靶点。然而，开发一种化合物既能够识别Aβ，又能抑制Aβ纤维形成、消除淀粉样斑块，同时改善认知和缓解AD病理是目前AD药物开发的重大挑战。

为此，南开大学的张涛课题组和郭东升课题组合作设计了由环糊精（CD）和杯芳烃（CA）组成的共组装体，并将其用作一种以抗Aβ为机制的治疗药物。这一成果与2020年12月发表在《Advanced Materials》 上，题目为：Recognition and Removal of Amyloid-bby A Heteromultivalent Macrocyclic Co-assembly: A Potential Strategy for theTreatment of Alzheimer’s Disease。文章的第一作者是南开大学的博士王晖和博士研究生许心心、潘雨辰。

课题组之前的研究已经发现CD可以特异性结合Aβ中的酪氨酸，CA可以结合Aβ中的赖氨酸，并且CD-CA共组装体（CD-CA co-assembly）相比于单独的CD或CA组装体具有更好解聚Aβ纤维的效果。因此，本研究基于以下问题进一步探讨CD-CA co-assembly在AD治疗中的应用前景：是否共组装体（1）可以通过解聚Aβ纤维减轻细胞毒性，（2）消除AD模型小鼠脑中的淀粉样斑块，（3）恢复AD模型小鼠的认知障碍并减轻AD样的病理？

关键结果：

1、CD-CA co-assembly 解聚Aβ纤维并减轻Aβ纤维的细胞毒性

由于Aβ1-42序列中含有1个酪氨酸和2个赖氨酸，因此课题组根据Aβ的序列设计了CD: CA=1: 2的新共组装体。THT染色和MTT实验显示，CD-CA(1:2) co-assembly 相比于CD-CA (1:1) co-assembly表型出更好的解聚Aβ1-42纤维和阻止Aβ1-42纤维引起的细胞死亡的能力。TUNEL染色和Western blot检测凋亡相关蛋白（Bcl2, Bax, caspase9, caspase3）显示CD-CAco-assembly可以有效的阻止Aβ1-42纤维引起的细胞凋亡。通过检测ROS水平，SOD活力和MDA水平发现，CD-CA co-assembly可以明显的缓解Aβ1-42纤维引起的氧化应激.

2、CD-CAco-assembly降低5xFAD小鼠海马（HPC）和内侧前额叶皮层（mPFC）的淀粉样蛋白沉积。

由于体内和体外的环境和Aβ的存在形式有巨大的差异，因此作者进行了进一步的实验以确认CD-CA co-assembly是否可以降低AD模型小鼠脑中Aβ1-42的水平。作者将CD-CA co-assembly注射到2月龄的5xFAD小鼠的海马齿状回（DG）区域，免疫荧光分析显示，注射CD-CA co-assembly 24小时后Aβ荧光强度显着降低，并且注射48小时后荧光强度进一步降低。

尽管2月龄的5xFAD小鼠出现大量淀粉样斑块，但没有显着的认知障碍。在后面的实验中，作者使用6月龄的5xFAD小鼠来研究长期施用CD-CAco-assembly是否能够通过降低淀粉样斑块的水平来改善AD的病理。作者制备了负载PFBT的CD-CA（CD-CA-PFBT）纳米颗粒以追踪大脑中共组装体的分布，发现鼻腔给予CD-CA-PFBT co-assembly一个月后，可以在脑内明显的检测到PFBT荧光。通过免疫荧光标记Aβ和ThioS染色发现，鼻腔给予CD-CA-PFBT co-assembly一个月后可以显著降低5xFAD小鼠海马（HPC）和内侧前额叶皮层（mPFC）的Aβ水平和淀粉样斑块数量。

大量解聚淀粉样斑块的化合物在实际临床中表现出很小的治疗效果甚至加重疾病，其主要原因是在于淀粉样斑块能够解聚成更具神经毒性的可溶性寡聚体。因此，作者进一步研究了CD-CA-PFBT co-assembly是否有效降低了各种形式的Aβ1-42的水平并促进了Aβ1-42的降解。ELISA结果显示，CD-CA-PFBT co-assembly显著降低了5xFAD小鼠HPC和mPFC中不溶性、可溶性Aβ1-42和Aβ1-42寡聚体水平。Western blot结果显示，CD-CA-PFBT co-assembly恢复了5xFAD小鼠中与Aβ1-42降解相关的脑啡肽酶 (NEP)的水平。

3、CD-CA-PFBT co-assembly改善AD小鼠的认知障碍

认知障碍是AD最典型的特征之一，被认为与淀粉样斑块的沉积密切相关。本研究通过新异物体识别实验（NOR）评估小鼠海马依赖的识别记忆能力。结果显示，在训练阶段各组之间的识别指数（RI）没有显着差异；但是在测试1和测试2的阶段， CD-CA-PFBT co-assembly处理的5xFAD小鼠比PBS处理的5xFAD小鼠显示出更高的RI。随后通过Morris水迷宫（MWM）评估海马依赖的空间学习和记忆能力。结果显示，在训练阶段6月龄5xFAD小鼠比WT小鼠表现出更长的逃避潜伏期，CD-CA co-assembly可以显著降低5xFAD小鼠第2-5天的逃避潜伏期。在测试阶段，CD-CA co-assembly可以显著提高5xFAD小鼠在目标象限的停留时间和穿越虚拟平台的次数。

4、CD-CA-PFBT co-assembly改善AD小鼠的突触可塑性损伤

突触可塑性是大脑学习和记忆的细胞学机制。长时程增强（LTP）是记忆形成和储存的机制，反映了哺乳动物大脑的经验依赖性可塑性。作者记录了海马内穿通纤维（PP）-齿状回（DG）的兴奋性突触后电位（fEPSP）。结果显示，CD-CA-PFBT co-assembly可以显著提高5xFAD小鼠LTP。Golgi-Cox染色显示，CD-CA-PFBT co-assembly显著提高5xFAD的树突棘密度。Western blot和免疫荧光结果显示，CD-CA-PFBT co-assembly显著提高突触相关蛋白SYP、PSD95和NR 2A的水平。

5、CD-CA-PFBT co-assembly改善AD小鼠的神经元凋亡和氧化应激

神经元的凋亡和氧化应激是AD的重要的病理特征，与认知能力和突触可塑性的损伤密切相关。结果显示，CD-CA-PFBT co-assembly可以显著缓解5xFAD小鼠HPC和mPFC神经元的凋亡和氧化应激。

6、CD-CA-PFBT co-assembly改善AD小鼠的神经炎症和小胶质细胞的功能紊乱

越来越多的研究显示，神经炎症参与了AD的发生和发展。因此，作者通过Western blot检测HPC和mPFC中炎症因子iNOS、COX2和IL-1β的水平。结果显示，CD-CA-PFBT co-assembly显著降低了5xFAD小鼠HPC和mPFC炎症因子的表达。小胶质细胞在神经炎症中起关键作用，并被认为炎症的主要来源细胞。作者用Iba-1的特异性抗体标记小胶质细胞，用ThioS特异性的标记淀粉样斑块。发现在5xFAD小鼠中，大量小胶质细胞分布在淀粉样斑块周围，CD-CA-PFBTco-assembly明显减少斑块周围小胶质细胞的数量。统计小胶质细胞形态发现，CD-CA-PFBTco-assembly处理后，5xFAD小鼠的小胶质细胞分支长度和小胶质细胞分支数均明显提高，说明CD-CA-PFBT co-assembly可以阻止5xFAD小鼠小胶质细胞的激活。

基于促炎因子或抗炎因子的表达，小胶质细胞表现出两种功能表型，M1(classical activation) 型和M2 (alternative activation)型。M1型小胶质细胞过度活化和M2型小胶质细胞损伤导致小胶质细胞极化失衡，促进AD的发展。因此，本研究采用Iba-1和CD86（M1型小胶质细胞标记物）或Iba-1和CD206（M2型小胶质细胞标记物）共染色来评价小胶质细胞的极化。结果显示，CD-CA-PFBTco-assembly降低了5xFAD小鼠中M1型小胶质细胞的数量，提高了M2型小胶质细胞的数量，恢复了小胶质细胞极化失衡。

总结与展望：

近年来Aβ为靶点的AD药物的研发屡屡受挫，其原因多种多样，包括：靶点选择的缺陷（如：γ-分泌酶、GSK3β）；寡聚体的形成、体内淀粉样斑块结构的复杂性、药物的毒性和脑内药物含量低等。鉴于其对Aβ的强键合能力、对认知和AD病理的良好的改善作用和较低的毒性，CD-CA co-assembly将有望成为一种治疗AD的潜在药物。此外，杂多价共组装策略在治疗其他由蛋白异常聚集引起的神经退行性疾病（包括帕金森病和亨廷顿舞蹈病）也将有广阔的应用前景。

编译作者：胖兔子可可 (Brainnews创作团队)

校审： Simon (Brainnews编辑部)